该公式说明了淘选和筛选过程中抗原的浓度选择对于淘选效率和筛选区分度的影响。
对于该公式的使用笔者选取亲和力Kd为1nM的抗体Ab1和选取亲和力Kd为10nM的抗体Ab2为例以下图进行说明。如果input的展示Ab1（红色实线）和展示Ab2（蓝色实线）的噬菌体的量是一样的。
在抗原浓度为10nM的条件下，90%的Ab1展示phage和50%的Ab2展示phage能够被抗原捕获，这样亲和力强的Ab1相对于亲和力弱的Ab2有更多的phage被淘选下来进入下一轮的扩增和淘选，如此2-3轮，强亲和力的Ab1展示噬菌体相对于弱亲和力的Ab2展示噬菌体有更多的富集，弱亲和力的Ab2相对于非特异或更弱结合的phage有更多的富集；
如果将抗原浓度为1nM的条件下，50%的Ab1展示phage和9.1%的Ab2展示phage能够被抗原捕获，无论Ab1还是Ab2淘选的phage均有减少，但是淘选下来的Ab1/Ab2的量比值由抗原浓度为10nM时1.8倍上升到了5.5倍(绿色虚线)，抗原浓度减少时，Ab1相对于Ab2有更多的富集，抗原的浓度越少对抗体的亲和力大小越具有选择性。
淘选和筛选优化的基本原则
抗原浓度的变化引起的不同亲和力的阳性噬菌体结合的量和比例的变化规律指导实验人员在淘选过程中抗原浓度条件的设定时，从第一轮淘选到第三轮淘选，抗原浓度应是逐步降低的过程。3
第一轮淘选过程中input的噬菌体文库中多样性的每个噬菌体的拷贝数一般为10-100个，为了尽可能将弱结合能力(uM级别)的抗体展示phage也保留住，高浓度的抗原如10ug/ml进行淘选是非常有助于得到一个亲和力跨度较大多样性较好的阳性噬菌体文库。
在第二轮和第三轮筛选过程中可根据单克隆测序的结果将抗原浓度逐级降低到5ug/ml，2ug/ml等使得阳性噬菌体在进一步富集的同时亲和力更强的噬菌体得到更多数量的富集，如下图所示为一个经过三轮淘选后阳性噬菌体库感染TG1后挑选单克隆测序,利用Vbase进行抗体轻重链的CDR分析的概念图(序列纯属虚构,如有雷同纯属巧合),20个序列中只有6个特异序列,其中一个序列6个重复,2个序列有4个重复,1个序列分别有3个,2个,1个重复.实验结果中有重复序列出现说明淘选过程使得具备亲和力的噬菌体得到了富集,序列收敛,有多个序列出现重复说明阳性噬菌体文库的多样性得以保留,特异序列重复的次数暗示着此序列可能亲和力强的序列,但序列的富集程度还跟该克隆的噬菌体扩增的效率和展示的效率有关,序列重复的次数和亲和力强弱之间没有绝对的相关性。
经过合适轮数筛选阳性噬菌体得以富集并且阳性多样性得以保留的阳性噬菌体库可感染TG1后挑选单克隆后进行利用ELISA进行高通量筛选,高通量筛选的目的是将不同阳性噬菌体的亲和力强弱得以区分,ELISA检测信号强的克隆其亲和力强.要达到以上的目的,根据上文的公式两个亲和力相差10倍的展示噬菌体在抗原浓度为10nM,其信号差异为1.8倍,而在抗原浓度为1nM时其信号差异为5.5倍,尽可能少的抗原浓度和阳性噬菌体进行反应是提高筛选信号大小和亲和力强弱的关键.在实际操作过程中,受限于微孔板中噬菌体的产量,ELISA方法的检测灵敏性,ELISA各个环节的非特异交叉反应等,一个区分度很好的噬菌体展示筛选方法需要对ELISA各个环节的各个试剂耗材进行优化,下图是笔者进行一个噬菌体展示筛选方法开发时的优化方向以供各位同行参考,具体内容暂不作展开。
淘选效率的其他考量
噬菌体淘选的过程决定了能够得到多少特异的阳性噬菌体，筛选的过程是以数据大小的形式对多样性的阳性噬菌体的亲和力做一个初步的比较排序。相较而言，淘选过程在抗体发现过程中有着更重要的地位，在淘选过程中除了考虑噬菌体和靶点抗原的结合富集外，还需要考虑噬菌体和淘选过程中其他试剂物质材料的非特异或者非预期的结合，如噬菌体淘选溶液中的封闭剂蛋白成分的结合或者噬菌体和固体载体间的非特异吸附等，经过2-3轮淘选后也能够进行富集，这样如下图所示将噬菌体文库在和抗原相互作用之前或者相互作用之后和除抗原外的其他试剂材料成分提前孵育一段时间进行负向筛选是很有必要的事情4。负向筛选的模式对于以细胞为载体的靶点(肿瘤原代细胞或者高峰度表达抗原的稳转细胞)淘选，蛋白靶点特定位点（如pMHC）的淘选均有很好的指导意义。
将抗原包被在固体载体表面，抗原以一个面吸附在固体载体上往往会导致部分抗原的位点被屏蔽的现象，采用生物素标记抗原和噬菌体作用后再结合到有链霉亲和素的固体载体上能够有效的避免此类现象（称之为液相淘选），在这类实验设计的过程中注意生物素抗原的量和固体载体能够捕获的生物素抗原的量的关系。根据本人的实验经验蛋白和噬菌体在液相中的结合力相对于两者在液固两相中的结合力要弱，液相淘选更能够淘选得到亲和力较强的阳性噬菌体文库，将靶点蛋白生物素标记后加入链霉亲和素的固体载体中反应再和噬菌体进行反应也是能够避免抗原位点被屏蔽的同时保留弱亲和力的阳性噬菌体的折中方案。
展望：
噬菌体展示相对于杂交瘤在进行抗体发现的过程中有一个非常大的优势的一点在于噬菌体展示可添加负向筛选的过程，该过程能够使噬菌体展示技术能够对于靶点抗原的特定表位进行精确的抗体发现，相较于杂交瘤技术有更高的抗体发现效率如pMHC为靶点的TCRlikeantibody的发现5。抗原浓度对噬菌体展示淘选结果的影响可以理解为一种淘选压力，抗原浓度高则淘选压力低，抗原浓度低则淘选压力高，淘选压力除抗原浓度外，液相固相淘选，温度，pH值6，模拟肿瘤微环境的Buffer的成分等都可以作为一种可调节的淘选压力，通过灵活的调节淘选压力可以从噬菌体文库得到更多或者亲和力更强或者有某种特性的抗体，在中国新药研发逐步加入全球范围内的竞争格局下，有特色的将更具备价值，噬菌体展示技术的多方面更精密应用将是核心竞争力的源头技术。
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